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反相高效液相色谱系统流动相选择

2018-11-15

 高效液相色谱法由于其分离效率高、选择性好,检测灵敏度高,操作自动化,应用范围广等特点成为广大分析工作者的首选分析方法。流动相承担液相分离作用的重要作用,是液相色谱柱系统的大脑。能否选择合适的流动相,影响整个分析工作的质量。掌握流动相选择的理论知识对于分析工作者特别是药物分析工作者是非常必要的。选择用于分析的最合适的流动相是一件难以确定和非常困难的任务。虽然没有有关流动相选择的简易技巧、捷径、窍门或秘诀,但却有些理论来简化此过程,反相高效液相色谱流动相一般是由水相和有机相组成。

1、 有机相的选择

有机相是反相高效液相色谱系统流动相重要组成部分,对HPLC分离起到决定性作用。典型的反相高效液相色谱系统的有机相有:乙腈、甲醇、四氢呋喃、异丙醇、DMF,乙醇等。

a) 溶剂强度 

有机相溶剂强弱取决于疏水性的强弱。溶剂强度会决定洗脱一个给定化合物所需的量。下表是典型有机相的溶剂强度。

  从上表可知,四氢呋喃将更容易洗脱指定化合物,而甲醇洗脱同一个化合物所需量是最多的。混合溶剂洗脱强度=∑(溶剂强度×比例)。下图是乙腈与甲醇溶剂强度效果比较。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

可看出采用乙腈时分析物更早被洗脱出来,即使乙腈百分含量更低一些。用乙腈洗脱时洗脱顺序发生了变化。

b) 溶济极性

有机相溶剂极性越大,洗脱能力越弱。下表是典型溶剂极性指数。


从上表可知,异丙醇洗脱能力最强,四氢呋喃次之,但由于二者与水作为流动相会造成较大的系统压力,故,一般选择甲醇和乙腈作为有机相溶剂。

c) 溶剂粘度

溶剂的粘度直接影响系统运行压力,一般乙腈、甲醇可以使系统在低压力情况下达到1ml/min的运行流速、相比于其他有机溶剂更加节约分析成本。虽然四氢呋喃也具有比较低的粘度,但其与水混合粘度升高,会使柱压升高。下表是典型溶剂粘度指数。

从上表可知,甲醇和乙腈可以适应更多的体系,四氢呋喃与水作为流动相时,必须要经过超滤脱气处理,并且系统需要很长的平衡时间。

d) 截止波长 

当检测波长低于溶剂截止波长时就会生产较大干扰,一般来说有机相溶剂的截止波长低于检测波长的10~20nm时,是最优选择。下表是典型溶剂截止波长指数。

从上表可知,乙腈和甲醇较其他有机相溶剂可以适应低波长检测。

a) 其他因素

除以上因素还需要考虑:不能与样品相互作用;对样品有一定的溶解能力;不能与固定相相互作用;样品易于回收。

1、 水相的选择

一般化合物可以用纯水作为水相,HPLC用水除满足药典的要求外,还要求电导率不得小于18MΩ·cm25℃时),TOC不得大于0.5mg/ml,在190nm200nm250~400nm的吸收度分别不得大于0。010.010.05。使用前需经过0。22μm滤膜过滤。

a) pH值的选择

对于弱酸或者弱碱化合物,一般需要通过在水中加入弱酸或弱碱调节流动相pH值来抑制样品组分的解离,增加组分在固定相上的保留,并改善组分峰形,使化合物能得到很好的分离。

酸性化合物:

分离酸性化合物时,当流动相的pH值低于酸性化合物的pKa值时,酸性化合物主要以分子形成存在在反相体系中具有非极性化合物的行为,增加与固定相的疏水作用,增加保留能力。当流动相的pH值高于酸性化合物的pKa值时,酸性化合物离子化后会具有极性化合物的行为,减少与固定相的疏水作用,降低保留能力。下图是pH值对酸性化合物保留的影响。

事实上,当流动性pH值在pKa±1.5范围外时,化合物完全解离或不解离,流动相pH值对酸性化合物保留影响较小。当流动相的pH值与酸性化合物pKa值的差值的绝对值大于2时。这时酸性化合物在流动相体系中分子态浓度与离子态浓度相差100倍。通过调节流动相pH值,可以使化合物有较好的峰形并且可以保持保留的恒定。理论上,当流动相pH值高于酸性化合物pKa2个单位时,酸性化合物在流动相中的分子态:离子态=1:100,带电离子在柱子上更容易与填料作用使色谱峰拖尾或峰形很差。因此,对于酸性化合物的流动相pH值优先选择低于pKa2个单位。

 

碱性化合物:

分离酸碱性化合物时,流动相pH值应该pKb±2以外进行调节,并且优先选择高于pKb2个单位。

b) 缓冲盐的选择

当被分析化合物在反相色谱体系中极容易离解(一般是具有氨基或羧基官能团化合物)或者被分析化合物pKa值小于2.0pKb值大于8.0时,被分析物在流动相中分子态比例相比于离子态不能占据绝对优势,固定相表面残留硅醇基团与带电离子相互作用,导致峰形难看或拖尾。而此时一般缓冲液不能抑制被分析化合物离子化,就需要加入缓冲盐体系使得被分析化合物的离子平衡向“中性”形式移动,利于在反相系统中的分配,此外缓冲盐体系能“覆盖”残留硅醇基团,阻止其吸附被分析化合物分子和参与离子保留。

盐浓度:缓冲盐溶液在HPLC泵头内极易出现高压盐析现象,会磨损密封垫导致漏液。一般缓冲盐浓度选定5~50mM,通常以样品浓度的2~5倍为选定值。使用梯度洗脱时,流动相有机溶剂最高比例不得大于90%

缓冲盐种类:常用的缓冲盐有磷酸盐(包括一盐和二盐)、柠檬酸盐(包括一盐和二盐)、甲酸盐、乙酸盐、钾盐、钠盐、铵盐等。理论上从数量众多的缓冲盐中选择合适的缓冲盐是不容易的,不过,只要把握好以下几点,基本能解决绝大多数问题。

c) 离子对试剂的选择

离子对试剂主要用于极性较大,在反相色谱系统中不易保留的被分析物。流动相中添加离子对试剂后,离子对试剂与被分析物(一般在溶液中显与离子对试剂相反电荷)结合成离子对而呈中性,使被分析物表现非极性化合物行为,增加在色谱系统中的保留。

常用的离子对试剂:酸性被分析物一般选择阳性离子对试剂(四丁基溴化铵、四丁基硫酸氢铵等),而碱性被分析物一般选择阴性离子对试剂(烷基磺酸钠类)。离子对试剂的烷基C链越长,生成的离子对与固定相的亲和力越大,因此组分的保留值越大。

离子对试剂浓度:在使用离子对试剂时应尽可能的降低离子对试剂浓度,以保证对柱子损伤小其便于清洗。一般选择5mM浓度的离子对试剂。

 

 

 

 

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