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浅谈流动相pH值对色谱分析的影响

2018-11-08

 在用高效液相色谱进行药物分析方法开发的过程中,色谱柱及流动相的种类,添加剂的引入,流动相的pH值调节,温度的控制等等都会对分离选择性产生影响。而其中,色谱柱及流动相的选择往往起着决定性的作用,对于流动相pH的控制,不仅会对色谱柱的稳定性产品影响,并且会对分离的选择性和色谱峰的对称性产生至关重要的作用,尤其是针对某些可以离子化的极性酸碱化合物来说。

一般来说pH对于中性化合物几乎没有什么影响。这是因为一般情况下中性化合物不具备解离能力,因而不会对谱图的分离选择性及峰形的对称性产生影响。对于含有极性官能团的化合物来说,pH会影响化合物的存在状态。进而影响分离选择性及色谱峰的对称性。除此之外,一些做了改性或者Mixed-Mode类型的色谱柱,即便分析物中不含有可电离的物质,但是pH值会影响色谱柱上的官能团状态,进而也会影响到中性化合物的分析。因此在进行方法开发之前,首先要对所选的色谱柱及本身样品所含成份的定性认知。

下图展示的是不同pH对于中性非极性化合物、极性不可解离化合物以及极性可解离化合物的分离选择性的影响。

 

查阅文献可以看出,当水溶液的pH偏离化合物本身pKa 2个单位以上时,化合物主要以一种形态存在,而当pH在化合物本身pKa 2个范围以内时,化合物以两种形态存在(不解离与解离形态),而当溶液的pH等于化合物本身的pKa的时候,化合物解离形态与不解离形态大约各占50%,如下图所示。

 

极性可解离化合物的容量因子与pH之间呈现S型曲线。对于碱性化合物而言,pH越大,其容量因子也越大;对于酸性化合物而言,pH越小,其容量因子也越大,这也是在使用反相HPLC“酸加酸,碱加碱”的原因,其目的在于抑制酸碱极性化合物的离子化作用,增强与C18固定相之间的相互作用,而提高该类化合物的保留时间。同时需要注意的是:在进行方法开发的时候,尽量选取酸的高保留平台去和碱的高保留平台区,如果在中间斜率比较大区域,在pH值稍微有些变化的时候就会对峰形、保留时间、分离度有很大影响。

 

 PH的大小影响到极性可解离化合物以及色谱柱硅羟基的解离程度,离子化的分析物在典型的ODS反相色谱柱上往往会出现拖尾现象。通过改变流动相的pH,抑制其解离,可改变极性可解离化合物的容量因子,改变其出峰位置,提高分离的选择性,且提高色谱峰的对称性。此外,有机相的添加会使得流动相的pH以及待分析化合物的pKa发生改变,因此在调节流动相pH的时候,最好将此部分也考虑进去,在色谱柱的耐受范围内,尽可能地调节pH远离化合

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